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siRNA搅扰FOXF2对人宫颈癌SiHa细胞体外搬运的影响

刘丽敏++++++史文娟++++++何芳++++++伍雪梅[摘要]意图研讨siRNA搅扰叉头框转录因子F2(FOXF2)对人宫颈癌SiHa细胞体外搬运才能的影响及其效果机制。办法选用RT-PCR、Westernblot别离检测siRNA-FOXF2转染前后,SiHa细胞中FOXF2mRNA、蛋白的表达改变;一起用划痕试验和Transwell侵袭试验别离检测siRNA-FOXF2转染前后细胞的搬

刘丽敏++++++史文娟++++++何芳++++++伍雪梅

[摘要]意图 研讨siRNA搅扰叉头框转录因子F2(FOXF2)对人宫颈癌SiHa细胞体外搬运才能的影响及其效果机制。办法 选用RT-PCR、Western blot别离检测siRNA-FOXF2转染前后,SiHa细胞中FOXF2 mRNA、蛋白的表达改变;一起用划痕试验和Transwell侵袭试验别离检测siRNA-FOXF2转染前后细胞的搬迁和侵袭才能,CCK8检测siRNA-FOXF2转染前后细胞的增殖才能。成果 SiHa细胞内FOXF2敲除后,RT-PCR、WB检测显现siRNA-FOXF2转染组FOXF2的蛋白、mRNA均显着下降;划痕试验和Transwell侵袭试验显现细胞侵袭、搬迁才能增强;CCK8检测显现siRNA-FOXF2转染组促进细胞增殖才能(P<0.01)。定论 siRNA搅扰FOXF2促进SiHa细胞的体外搬运才能及细胞增殖才能,进而促进宫颈癌的发作开展。

[关键词]宫颈癌;叉头框转录因子F2;SiHa细胞;细胞搬迁;细胞侵袭;细胞增殖

[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2017)03(c)-0004-04

[Abstract]Objective To explore the effect of siRNA silencing FOXF2 on invitro metastasis of human cervical carcinoma SiHa cells and its mechanism.Methods The expression of FOXF2 mRNA and protein in SiHa-siRNA-FOXF2 cells and negative control cells were detected by RT-PCR and Western blot respectively. The migration and invasion ability of cells were detected by wound-healing assay and Transwell assay before and after siRNA-FOXF2 transfection.CCK8 was used to detect the proliferation of cells before and after siRNA-FOXF2 transfection.Results The expression of FOXF2 mRNA and protein in siRNA-FOXF2 transfected group was significantly decreased after FOXF2 knockout in SiHa cells by RT-PCR and WB detection;the invasion and migration were enhanced by wound-healing assay and transwell assay.After transfection of siRNA-FOXF2 into cervical cancer SiHa cell lines,the capability of cell proliferation was significantly enhanced (P<0.01).Conclusion siRNA-FOXF2 can promote the invitro metastasis and proliferation of SiHa cells,and promote the development of cervical cancer.

[Key words]Cervical cancer;FOXF2;SiHa cells;Cell invasion;Cell migration;Cell proliferation

宫颈癌是临床常见的妇科恶性肿瘤,其发病率居女人恶性肿瘤第3位,死亡率居第4位[1],且发病趋势呈低龄化[2]。现在首要的医治办法是宫颈癌彻底治好术和放化疗,其对前期患者的治好率高达80%~95%,但关于晚期和复发搬运的患者仍无令人满意的医治办法。因而,从分子水平研讨宫颈癌的发病和防备机制,采纳针对性的靶向医治火烧眉毛。叉头框转录因子F2(forkhead boxF2,FOXF2)蛋白为FOX转录因子宗族中的成员之一,首要存在于泌尿道、呼吸道和消化道等体系器官的附近上皮间质细胞,其参加细胞外基质(extracellular matrix,ECM)组成[3]、胚胎及安排发育[4]以及上皮与间质之间的彼此转化[5]等。有研讨报导,FOXF2的低表达与乳腺癌的发作和搬运亲近相關[6],FOXF2高表达于正常前列腺安排和前列腺良性肿瘤,低表达于前列腺癌及淋巴结搬运[7-8]。但现在有关FOXF2基因在宫颈癌分子机制研讨的相关报导较少。本研讨旨在评论FOXF2搅扰宫颈癌SiHa细胞的分子机制,为临床医治宫颈癌的靶点供给理论根据,现报导如下。

1材料与办法

1.1材料

人宫颈癌细胞株SiHa购自我国科学院上海生命科学研讨院生物化学与细胞生物学研讨所细胞库;DMEM购自美国Gibco;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,natocor)、Transwell小室购自美国Corning公司。转染试剂脂质体Lipofectamine TM 3000(LTP03000)和OptiMEMⅠ Medium购自美国Invitrogen公司;Matrigel基质胶购自美国BD公司。FOXF2 siRNA由上海吉玛制药技能有限公司组成,包括3对意图siRNA,1对阴性对照siRNA。Si-FOXF2 1415序列为:5′-GCGUCUGUCAGGAUAUUAATT-3′;Si-FOXF2 1305序列为:5′-GCAUCACUCUACUCCAGUGTT-3′;Si-FOXF2 650序列为:5′-CCAGCGAGUUCAUGUUCGATT-3′;搅扰阴性对照组siRNA序列为:5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3′,RT-PCR试剂Takara,日本。

1.2办法

1.2.1细胞培育 SiHa细胞复苏后,参加含10%FBS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的DEME中培育,置入37℃、5%CO2培育箱内,24 h内换液。取对数成长期的细胞,用0.25%胰酶消化、传代、冻存。

1.2.2细胞转染 将培育SiHa细胞分为5组:转染阴性对照组(阴性)、Si-FOXF2 1415组(1415)、Si-FOXF2 1305组(1305)、Si-FOXF2 650组(650)及未经任何处理的SiHa细胞作为对照组(NC)。转染前一天将SiHa细胞接种于6孔板中,转染时细胞融合到达30%~50%,PBS清洗3遍,每孔参加900 μl无血清培育基。将5 μl的siRNA和3 μl的Lipo3000别离与50 μl的OptiMEMⅠMedium混悬,悄悄混匀后静置5 min。将含有siRNA和Lipo3000的OptiMEMⅠ Medium悄悄混匀后静置20 min。将每孔100 μl混匀的DNA脂质体复合物均匀滴入含有无血清培育基的细胞中。48 h后停止提样。

1.2.3 RT-PCR检测各组FOXF2 mRNA的表达 结尾提取RNA,选用紫外/可见光分光光度仪丈量细胞样品总RNA的浓度和纯度[D(260 nm)/D(280 nm)剖析RNA浓度在1.9~2.1之间提示RNA质量杰出]。随后按Takara反转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。规划引物序列为:FOXF2上游:5′-TCGCTGGAGCAGAGCTACTT-3′;下流:5′-CCCATTGAAGTTGAGGACGA-3′;GAPDH上游:5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′,下流:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。终究取得转染率最高的SI-FOXF2序列。

1.2.4蛋白印迹法检测挑选后的3组FOXF2蛋白的表达 按上述办法转染细胞,分为Si-FOXF2阴性对照组、Si-FOXF2组和未经任何处理的SiHa细胞作为对照组。72 h后用全蛋白提取试剂盒(江苏凯基生物技能股份有限公司,南京)提取蛋白,BCA蛋白试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司,北京)测蛋白浓度,以GAPDH为内参,按10%别离胶、6%浓缩胶浓度制胶,按浓缩胶80 V、别离胶120 V恒压电泳,200 mA转膜1 h,5%BSA关闭2 h,TBST洗刷后孵一抗(兔抗人FOXF2 1∶1000,兔抗人GAPDH 1∶10000,Abcam)4℃过夜,次日洗刷后二抗(羊抗兔1∶2000,CST)1 h,洗刷,ECL显影(merckmillipore)。试验重复3次。

1.2.5细胞划痕试验 待转染后细胞数达90%成长融合时,用200 μl移液枪头沿培育板底部呈一字型划痕,用PBS洗3遍,换上无血清的培育基,别离于培育0、12、24、36、48 h在倒置显微镜下(10×10)丈量划痕的宽度。细胞搬迁率(%)=(1-即时划痕宽度/原始划痕宽度)×100%。

1.2.6 Transwell侵袭试验 用50 μl Matrigel稀释液(1∶4)包被Transwell小室。取Si-FOXF2阴性对照组(Si-Ha NC组)、Si-FOXF2 650组和未处理SiHa组(SiHs组)的细胞,用无血清培育基重悬细胞,上室参加200 μl(3×104)细胞悬液,下室参加含20%FBS的DMEM培育液500 μl,每组重复3孔,培育箱内惯例培育48 h。取出小室,PBS洗刷3遍,4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗刷3遍,用棉签擦去上室细胞,结晶紫染色30 min,洗刷,倒置,风干,显微镜下摄影。每个滤膜随机选取5个200倍视界,计数穿膜细胞数,以此表明肿瘤细胞的侵袭才能。

1.2.7 CCK8检测细胞增殖试验 取转染24 h后Si-FOXF2阴性对照组(SiHs组)、si-FOXF2 650组和未处理SiHa组的细胞(SiHa Nc组),用10%FBS血清培育基重悬细胞,在96孔板中参加100 μl(9×103)的细胞悬液,将培育板在培育箱预培育24 h。PBS洗刷3遍,将每孔参加10 μl CCK8及90 μl无血清培育液的混合液,避光,将培育板在培育箱内孵育1~4 h。酶标仪测定450 nm处的吸光值。核算细胞活性公式:细胞增值率(%)=[处理组D(450 nm)-空白孔D(450 nm))/(空白对照组D(450 nm)-空白孔D(450 nm)]×100%。

1.2.8統计学处理 选用GraphPad Prism软件进行统计剖析,计量材料用均数±标准差(x±s)表明,组间比较选用t查验。以P<0.05为差异有统计学含义。

2成果

2.1 siRNA-FOXF2搅扰对SiHa细胞FOXF2 mRNA表达的影响

RT-PCR成果显现:3对意图siRNA-FOXF2搅扰后FOXF2 mRNA较转染阴性对照组及对照组显着下降(70%~85%),siRNA-FOXF2 650链下降最显着,差异有统计学含义(P<0.01)。选取siRNA-FOXF2 650链进行后续试验(图1)。

2.2 siRNA-FOXF2搅扰对SiHa细胞FOXF2蛋白表达的影响

Western blot成果显现:siRNA-FOXF2 650搅扰后,siRNA-FOXF2 650组细胞FOXF2蛋白表达水平显着低于转染阴性对照组及对照组,差异有统计学含义(P<0.01),进一步证明转染成功(图2)。

2.3 siRNA-FOXF2搅扰对SiHa细胞搬迁力的影响

细胞划痕试验显现,siRNA-FOXF2搅扰后,siRNA-FOX F2 650组细胞的搬迁才能显着高于转染阴性对照组及对照组(P<0.01)(图3)。

2.4 siRNA-FOXF2搅扰对SiHa细胞侵袭力的影响

Transwell侵袭试验显现,转染组穿过小室滤膜的SiHa细胞数显着多于转染阴性对照组及对照组,即siRNA-FOXF2 650组细胞侵袭才能高于转染阴性对照组及对照组(图4)。

2.5 CCK8检测siRNA-FOXF2搅扰对SiHa细胞增殖的影响

CCK8试验成果显现:siRNA-FOXF2 650组细胞增殖率显着高于阴性转染对照组及对照组(P<0.01)(图5)。

3评论

宫颈癌严重威胁女人健康,发病率逐步上升,仅次于乳腺癌,且出现年轻化趋势[9-10]。宫颈癌的侵袭性强,发作盆腔搬运的宫颈癌患者其术后复发率约为70%[11]。宫颈癌变是外源性和内源性多个致癌要素致使抑癌基因失活以及致癌基因激活效果下构成的一个绵长杂乱的进程[12]。临床追寻调查所显现,一般从宫颈癌前病变逐步演变成宫颈癌的时刻大约为10年[13]。从这一时刻来看宫颈癌是能够防备、前期发现且能够治好的肿瘤。防治的突破点在于宫颈癌前病变的及时发现、及时医治,阻断其向宫颈癌的进一步开展,因而探究宫颈癌发作及开展的分子机制关于宫颈癌的医治有着至关重要的含义。

FOXF2基因坐落人染色体6p25.3,编码一含有444个氨基酸的DNA结合蛋白,其分子量大约为46 KD[14]。FOXF2是间质特异性的转录因子,首要存在于泌尿道、呼吸道和消化道等器官的附近上皮间质细胞,其参加ECM组成[3]、胚胎及安排发育[4]、以及上皮与间质之间的彼此转化[5]等。FOXF2经过调理细胞的极性进而保持安排的稳态,其在胚胎发育及安排分解的进程中发挥着重要效果[15]。FOXF2作为FOX宗族中的一员,对按捺恶性肿瘤的发作开展起着重要的效果,并且发现FOXF2在许多恶性肿瘤中的表达较低[16],并且FOXF2的低表达加速了肿瘤的成长、开展,预示着患者预后较差[17]。也有研讨报导FOXF2基因低表达能够促进小鼠肠道腺瘤的构成和成长[18]。siRNA搅扰FOXF2在小细胞肝癌中促进细胞增殖和抗细胞凋亡[6],这与本研讨成果共同,搅扰FOXF2后促进SiHa细胞的搬迁、侵袭、增殖。siRNA搅扰FOXF2,促进细胞的侵袭及增殖,加速肿瘤的开展,预示着预后不良。从这一视点为宫颈癌搬运的分子机制供给了理论根据。但本研讨仍有必定的局限性,僅在体外细胞水平得到了验证,体内试验有待进一步验证,进而判别其是否能够作为临床评价宫颈癌的预后目标。下一步将研讨上调FOXF2基因对宫颈癌SiHa细胞效果的分子机制,进而为FOXF2基因的靶点肿瘤防治研讨供给进一步的的试验根据和新思路。

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